一山怎能容二虎？色譜雙峰

俗話說的好，一山怎能容二虎？在我們(men) 日常實驗時，這個(ge) 道理也同樣適用。有實驗經驗的小夥(huo) 伴都知道，在HPLC分析中，如果色譜柱性能正常，樣品濃度適宜，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下，峰型應對稱而尖銳，如下圖1所示。 

（圖1）

（圖2）

如果色譜柱在使用過程中發現每個(ge) 峰的峰形都出現問題，先考察是否有連接問題。管線可能太長或太短，這種情況可能導致滲漏或峰分叉/拖尾。如果管線太長，密封圈位置不當，將發生滲漏。如果管線推出的距離不夠，將會(hui) 產(chan) 生一段死空間，形成混合腔，導致柱外體(ti) 積，使峰形變壞。

如果在樣品分析時發現每個(ge) 色譜峰都有雙峰出現，尤其在采用單一純物質時，所有的接頭都是正常連接，則可以確定是色譜柱出現問題了，一般是柱頭受損或者柱頭固定相汙染引起的。

如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為(wei) 一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相衝(chong) 洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物衝(chong) 掉，再反過來，一般情況下就行了。當然不反衝(chong) ，正衝(chong) 有時也會(hui) 正常的。

如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變髒或流失可能性更大，建議按照說明書(shu) 進行日常或異常的再生衝(chong) 洗。如果衝(chong) 洗無法改善出峰情況，建議聯係色譜柱廠商進行排查或維修。

如果樣品基質比較髒，使用一段時間之後，發現的峰分叉或拖尾等問題，很有可能是保護柱失效造成的。一般粗略判斷標準，塔板數、壓力或分離度的改變超過10%，就需要更換保護柱了。保護柱是消耗品，建議直接更換，不需要再生。 

當用溶劑極性強度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體(ti) 係中以水為(wei) 主時，如果樣品進樣量大，如定量管為(wei) 20μL，此時單一的純物質會(hui) 出現雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會(hui) 提前（相對進樣量少而言），將進樣量減少一半以上，峰型將變為(wei) 正常。這是樣品的溶劑與(yu) 流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的溶劑效應問題，該情況的異常建議用流動相作為(wei) 稀釋劑或減少進樣量以消除溶劑效應。

另一個(ge) 原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由於(yu) 進樣量過大，色譜柱過載造成的。

目前HPLC分析多為(wei) 反相色譜，流動相多為(wei) 甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與(yu) 流動相相溶的溶劑溶解，最佳的溶解方法是用流動相溶解。在實際分析中，有時候為(wei) 了樣品的溶解性或穩定性加入了一點的緩衝(chong) 液，緩衝(chong) 液的酸堿性可能會(hui) 導致樣品轉化，從(cong) 而產(chan) 生雙峰現象。此時需要更換緩衝(chong) 液，調整溶劑pH值，或者用流動相配置樣品。

此外，樣品要現配現用，避免樣品溶解液的有機相比例、pH值發生變化而導致的溶劑效應。

有些樣品由於(yu) 其化學結構的特點，存在互變異構現象，而這種互變異構體(ti) 無法分開，而是以一個(ge) 動態平衡存在。在色譜分析時，在一個(ge) 特定的條件下（如pH值、流動相極性、溫度等），一種物質將出現雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現象將消失。

體(ti) 係pH值對色譜雙峰的影響出現在各個(ge) 環節上（前麵已經提到），尤其在緩衝(chong) 液流動相平衡過程中其影響更為(wei) 明顯。當連續進樣時，受pH的連續變化影響會(hui) 經常遇到這種雙峰的情況。另外，在樣品分析時，流動相的pH盡量遠離被分析物的等電點，否則也容易引起雙峰的產(chan) 生。在用離子對試劑分析時，選擇不好條件也會(hui) 容易引起雙峰的產(chan) 生。