液相色譜，你問我答（四）

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我們(men) 的《液相色譜，你問我答》已經發布三期了您困惑的問題，還有沒出現的嗎？如果有，那就快來看看這次有您想要的答案嗎~

Q1 我聽說有正相色譜和反相色譜，我想了解下什麽(me) 是正相色譜？什麽(me) 是反相色譜？它們(men) 有什麽(me) 區別呢？

答：其實正相色譜和反相色譜是由流動相和固定相極性大小差異來分類的，通常正相色譜固定相極性比流動相極性大，常用的流動相有正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等。而反相色譜剛好相反，是流動相極性比固定相極性極性大，常用的流動相有甲醇、乙腈、四氫呋喃、水等。反相色譜是目前Z通用的HPLC方法，大約95%的色譜工作者都在使用。

Q2 那我手上有一根色譜柱，我怎麽(me) 知道是使用於(yu) 反相色譜還是正相色譜呢？

答：目前來說，常用的反相填料有：C18、C8、C4 和苯基等；正相填料有：矽膠、氨基、氰基、二醇基等。

Q3 我通常看到有不同長度和內(nei) 徑的色譜柱，我能了解下色譜柱的長度和內(nei) 徑不同對我的色譜分析有什麽(me) 影響呢？

答：對於(yu) 色譜柱的長度和內(nei) 徑，我們(men) 可以基於(yu) 我們(men) 需要分析的物質的複雜程度來選擇，兩(liang) 支同填料的色譜柱，柱長越短，分離時間越快，但柱越長分辨率將會(hui) 更好，同時壓力也將更大，可結合樣品的複雜性和希望分離的時間來選擇合適的柱長。對於(yu) 色譜柱的內(nei) 徑，窄徑柱可提高柱的靈敏度，並可明顯降低溶劑的使用量；寬徑柱可以將係統死體(ti) 積的影響降到Z低，載樣量高，抗汙染。下表可供我們(men) 選擇色譜柱時對柱內(nei) 徑的一個(ge) 選擇。

Q4 那我想用不同內(nei) 徑和長度的柱子來進行色譜方法轉移，我該怎麽(me) 調整色譜條件呢？

答：對不同內(nei) 徑和長度的色譜柱，我們(men) 可以使用以下方法來轉換進樣量和流速：

Q5 我在看色譜柱的使用說明書(shu) 中，通常都會(hui) 提到柱體(ti) 積，那我怎麽(me) 計算我手上色譜柱的柱體(ti) 積呢？

答：基本上色譜柱的柱體(ti) 積計算公式都差不多，這裏列舉(ju) 月旭色譜柱柱體(ti) 積計算：
以4.6mm×150mm的柱子為(wei) 例：
柱管體(ti) 積=πr2L=π×(0.23)2×15=2.49cm2=2.5ml
2.5ml×70%(沒有填裝的體(ti) 積)=1.75ml=1個(ge) 柱體(ti) 積 

Q6 現在色譜填料的粒徑也有很多種，那我在色譜分析工作中，該怎麽(me) 選擇色譜柱的中填料的粒徑呢？

答：目前市場上主要可供選擇的分析用填料粒徑主要有以下幾種：
1.7μm、1.8μm、 2.2μm-----快速星空体育全站：匹配快速色譜儀(yi)
3.0μm、3.5μm-----快速星空体育全站：普通快速分析
5μm-----常規分析
其中5μm的粒徑是Z常用的，但是這裏是指平均粒徑是5μm，也有可能有3μm和5μm粒徑的填料。
當然色譜填料的粒徑越小，理論塔板高度越低，相應的柱效越高，分離度和靈敏度就越好，而且在高線速度區域，柱效的降低也得於(yu) 緩和；但是壓力會(hui) 成倍上升。通常我們(men) 會(hui) 結合色譜柱的長度來綜合選擇色譜柱的粒徑，下表可作為(wei) 色譜柱填料粒徑選擇的一個(ge) 參考。

Q7 那色譜填料的孔徑，我在測定什麽(me) 樣的產(chan) 品需要考慮呢？

答：現在多孔填料的 95%以上表麵積在孔內(nei) 部，這樣隻有分析目標物進入孔內(nei) ，才能達到分析分離的目的。而隻有樣品分子直徑小於(yu) 平均孔徑，才能進入微粒內(nei) 部。對於(yu) 小分子的反相分離，選擇小孔徑（60Å ~120Å）填料柱，對於(yu) 小分子和多肽，使用100Å ~150Å，而隻有當目標物的分子量大於(yu) 2000 時我們(men) 才會(hui) 選擇300Å孔徑的填料。 

Q8 那填料的比表麵積對我的分析物之間有什麽(me) 關(guan) 係呢？

答：每克填料的比表麵積與(yu) 孔徑和粒徑有關(guan) ，隨著孔徑的增加，比表麵積降低。目前比表麵積一般為(wei) ：180m2/g-350m2/g，隨著比表麵積增大，保留增加，載樣量增加，平衡時間增加（梯度洗脫尤為(wei) 注意）。我們(men) 在日常色譜分析工作中可根據需要選擇合適的比表麵積。

Q9 我在日常的色譜分析中，經常看到色譜條件中提到色譜柱的封尾，什麽(me) 色譜柱的封尾？為(wei) 什麽(me) 要封尾呢？

答：由於(yu) 空間位阻的存在，鍵合反應最多隻能覆蓋 50%的矽羥基，超過一半矽羥基是活性矽羥基，與(yu) 堿性基團會(hui) 發生離子交換作用，增加了保留，導致峰形拖尾，用短鏈氯矽烷（如三J基氯矽烷）鍵合活性的矽羥基，可以減小這種影響，這種操作被稱為(wei) 封尾，封端，封口。

Q10 封尾與(yu) 不封尾的色譜填料有什麽(me) 區別呢？

答：封尾消弱矽羥基作用；不封尾提高矽羥基影響，增強極性物質的保留，降低柱流失，但是有些物質會(hui) 在不封尾的柱子上產(chan) 生拖尾。