在實驗的過程中經常會(hui) 遇到保留時間不穩定的問題，我們(men) 也總接觸到相關(guan) 問題的技術谘詢。我們(men) 的技術工程師深知大家的痛點，特根據大家的反饋，梳理了一個(ge) 從(cong) 發現問題到處理問題的解決(jue) 思路。以後再遇到保留時間不穩定的問題，就可以輕鬆搞定啦。
保留時間不穩定，會(hui) 是什麽(me) 問題？
首先要找出變化的模式，
這個(ge) 會(hui) 幫助我們(men) 找到很多潛在的原因。
#1 保留時間在同一天變化大，同一瓶流動相，同一根色譜柱，同一台儀(yi) 器
1）首先檢查泵和混合器。使用秒表和量筒來檢測流速（設置儀(yi) 器流速1ml/min，用10ml量筒收集流出液10分鍾，應該得到液體(ti) 約10ml±0.5ml，量筒有誤差，使用的試劑與(yu) 儀(yi) 器廠家標定泵流速時試劑不一樣，最終體(ti) 積也有些差異，如果超過這個(ge) 範圍，再分開通道檢測，以找到流速不正確的原因，並排除）；
2）檢查流動相組成是否變化，可以在流動相中加入跟蹤劑來觀察基線的變化，例如：反相條件，UV檢測器，在有機相中加入0.1%丙酮，監測254nm下的基線變化，還有一種方法人工配製流動相，然後通過混合器，這時候保留時間穩定了，不再波動，那就是混合器工作不正常，或者混合不均勻，進行排除。
#2 保留時間一天之內(nei) 正常，不同天數之間變化
1）儀(yi) 器本身不太可能有問題，可能是流動相的組成變化引起的，在反相色譜中，保留因子k和流動相中的有機溶劑的體(ti) 積含量成指數關(guan) 係，根據經驗，如果有機溶劑含量誤差在1%，那保留時間的變化在5%-15%之間，大部分變化在10%左右，意味著用稱量有機溶劑的方式配置流動相能得到更穩定的保留時間；
2）流動相的脫氣方式也可能導致，*脫氣方式是使用真空超聲脫氣大約1分鍾左右，非真空條件下超聲脫氣5分鍾，這樣會(hui) Z大程度的減少溶劑的揮發，還有一種方法是流動相中通過氦氣，流動相被氦氣平衡後，氦氣流立刻關(guan) 閉，避免氦氣帶走溶劑蒸汽，而導致溶劑組成改變；
3）流動相的抽濾方式，通常情況下，如果我們(men) 使用有機溶劑和水相混合流動相時，會(hui) 先將流動相配置混勻好後，再進行抽濾，這樣的好處是流動相混合更均勻，但是對於(yu) 流動相中沸點較低的部分，在抽濾過程中會(hui) 損失更大，導致流動相溶劑組成改變，建議有機相和水相分開抽濾，再進行混合，超聲脫氣；
4）檢測目標物是離子狀態或者離子化的，那麽(me) 控製流動相的pH就非常重要，就算是0.1單位pH的變化都有可能導致保留時間漂移10%左右，所以準確稱量pH值並保證pH儀(yi) 被很好的校正了，在反相色譜柱中，隨著pH值的升高，酸的保留會(hui) 減少，堿的保留會(hui) 增加。
反相色譜中，分離離子或離子化的樣品，保留時間會(hui) 受到正確緩衝(chong) 溶液的離子強度的影響，但影響會(hui) 很小，可以不計，典型狀況是緩衝(chong) 鹽的摩爾數改變20%，保留時間的變化是1%，緩衝(chong) 鹽的組成通常是稱量的，那麽(me) 大的誤差是不會(hui) 發生的。
#3 保留時間漂移
還有影響保留時間的一個(ge) 重要問題就是保留時間漂移（一直延長或一直縮短）。
1）大部分工作者認為(wei) 漂移是平衡的問題，如果使用的是未修飾矽膠柱做正相色譜，這是最有可能的原因，使用半飽和流動相改善。反相色譜中，平衡通常會(hui) 很快，5-10個(ge) 柱體(ti) 積的流動相通常就足夠平衡了，但不全是如此，典型的就是離子對色譜中，使用離子對試劑平衡色譜柱，由於(yu) 離子對試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度，它們(men) 要吸附在反相色譜柱填料表麵，表麵濃度在0.5-2μmol/m2，1根4.6*250mm的色譜柱大約有3g填料，需要2mmol的離子對試劑進行*的柱平衡，流動相濃度為(wei) 2mmol時，那需要1L流動相進行平衡，這個(ge) 雖然是J端條件，但是用幾百毫升的流動相去平衡色譜柱也是正常的，因此離子對色譜中，使用了有機溶劑清除了離子對試劑，這樣第二天需要更長的時間平衡色譜柱。這兩(liang) 個(ge) 現象都是流動相中有低濃度的強吸附試劑導致的，這是保留時間漂移最常見的原因，也還有別的原因。
2）樣品中含有強吸附劑，在重複進樣中會(hui) 慢慢累積，從(cong) 而改變色譜柱的化學性質，如：藥品的賦形劑。可以通過觀察保留時間變化的速率來得知雜質是從(cong) 流動相中引入還是樣品中引入。實驗如下：
● 進樣幾次，如：進樣四次，共使用了1個(ge) 小時；
● 走相同量的流動相，不進樣；
● 重複第一步；
● 做一個(ge) 關(guan) 係圖；
保留時間：▲ 對時間的關(guan) 係 ▲ 對進樣次數的關(guan) 係
如果第一個(ge) 圖得到一條平滑的曲線，那麽(me) 流動相是引入雜質的原因，如果第二個(ge) 圖得到一條平滑的曲線，那麽(me) 雜質的來源是樣品。
3）鍵合相水解，色譜柱製造商會(hui) 製定一個(ge) pH範圍，超出範圍可能導致鍵合相不穩定，然而，很多情況下使用者不得不在接近這個(ge) pH極限，但是並沒有一個(ge) 明顯的分界線，因為(wei) 水解還取決(jue) 於(yu) 其他因素，如：溫度，有機溶劑，緩衝(chong) 鹽的濃度和種類，樣品的化學性質等，因此這個(ge) 水解也可能發生在這個(ge) pH範圍內(nei) 。要保存固定相的水解穩定性，最好是在中性pH值（3-5左右）和低溫下。等度條件穩定性優(you) 於(yu) 梯度條件，在等度條件下發生水解的過程中，鍵合相通常會(hui) 發生自我吸附，並達成一種區域平衡，在使用高濃度的有機溶劑時，在梯度時或者衝(chong) 洗色譜柱時，這種平衡會(hui) 被打破，鍵合相被衝(chong) 出色譜柱。
4）溫度的變化，如果樣品是自動分析過夜或者過了周末，那保留時間的漂移可能和實驗室的溫度變化有關(guan) ，在很多地方，室溫的設置在晚上或者周末是不一樣的，一般來講，1℃的變化導致保留時間的漂移大約在1%到2%。這個(ge) 可以聯係最後一個(ge) 導致保留時間漂移的原因--柱壓的增加，柱壓的異常升高，表明色譜柱被汙染，僅(jin) 僅(jin) 是篩板被堵塞就可能導致保留時間漂移，這是因為(wei) ，為(wei) 了使流動相通過篩板，需要額外的壓力來促使流動相通過篩板，這會(hui) 使流動相在摩擦的過程中受熱，從(cong) 而導致保留時間的漂移。
5）反相色譜鍵合相發生了“相塌陷”，由於(yu) 流動相中有機溶劑比例太少，高鍵合覆蓋率、“*封端”的C18沒有很好的被流動相浸潤，這會(hui) 使得流動相和固定相沒有很好的接觸，造成鍵合相卷曲，固定相之間相互吸附，從(cong) 而導致固定相可以和樣品相互作用的表麵積減少，使得保留時間逐漸變短。這時候立即用一定量的有機溶劑（建議40%乙腈水）衝(chong) 洗色譜柱可以使鍵合相恢複，這種現象在短鏈烷烴結合，未封尾的反相鍵合相上則很少發生，或者是不發生。
